大鼠肺大動脈內(nèi)皮細胞使用方法:

在技術(shù)部標準操作流程下，小鼠棕色脂肪細胞不建議傳代；建議您收到細胞后盡快進行相關(guān)實驗。

客戶收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1、取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置3-4h，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)；

2、待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)；

3、細胞傳代

1） 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2） 添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入完全培養(yǎng)液終止消化；

3） 用吸管輕輕吹打混勻，按1：2適當(dāng)?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的完全培養(yǎng)基至5ml，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）待細胞完全貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養(yǎng)基。**續(xù)寫內(nèi)容：**

4、注意事項
1）細胞傳代時需嚴格控制消化時間，避免過度消化導(dǎo)致細胞損傷。若消化不完全，可適當(dāng)延長消化時間，但需密切觀察細胞形態(tài)變化。
2）吹打細胞時動作應(yīng)輕柔，避免產(chǎn)生過多氣泡，以免影響細胞存活率。
3）傳代比例可根據(jù)實驗需求調(diào)整，但建議不超過1:3，以確保細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定。

5、凍存與復(fù)蘇（若需長期保存）
1）待細胞生長至對數(shù)生長期時，消化收集細胞，離心后加入適量凍存液（含10%DMSO的完全培養(yǎng)基），分裝至凍存管中。
2）采用程序降溫法（如4℃ 30min，-20℃ 1h，-80℃過夜）后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
3）復(fù)蘇時，迅速將凍存管置于37℃水浴中融化，離心去除凍存液后，用完全培養(yǎng)基重懸細胞并接種至培養(yǎng)瓶。

6、實驗建議
1）若細胞狀態(tài)不佳（如貼壁率低、生長緩慢），可適當(dāng)增加血清濃度（不超過20%）或更換新鮮培養(yǎng)基。
2）定期檢測細胞是否污染（如培養(yǎng)基渾濁、pH異常），若有污染跡象，應(yīng)立即終止培養(yǎng)并徹底消毒操作環(huán)境。

7、常見問題解答
Q：細胞傳代后為何遲遲不貼壁？
A：可能因消化過度或吹打力度過大導(dǎo)致細胞損傷，建議優(yōu)化消化時間并輕柔操作。
Q：培養(yǎng)基頻繁變黃是否正常？
A：若細胞密度較高，代謝旺盛會導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化，需及時更換；若細胞量少仍頻繁變黃，需排查污染可能。