大鼠原代角膜成纖維細胞的操作需嚴格遵循無菌原則、培養條件控制及質量保障規范，以確保細胞活性與實驗可靠性。

?一、樣本處理階段?
?取材與消毒?

取材后立即用含雙抗（青霉素+鏈霉素）的PBS沖洗5次以上，去除血污及雜質?。
角膜組織需在體視顯微鏡下精細修剪，避免殘留結締組織或上皮細胞污染?。
?組織消化?

推薦使用IV型膠原酶（37℃震蕩消化60分鐘）而非胰酶，減少對角膜基質細胞的損傷?。
消化后需用巴氏吸管輕柔吹打，避免過度機械剪切導致細胞碎片增多?。
?二、細胞培養階段?
?接種與貼壁?

培養皿需預包被鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）或多聚賴氨酸（0.1mg/mL），增強細胞貼壁性?。
接種密度建議為2×10? cells/mL，避免過高密度導致營養競爭?。
?培養基選擇?

使用含10%-20%胎牛血清的DMEM/F12培養基，血清批次需提前驗證穩定性?。
每2-3天換液，首次換液在接種后3天進行，避免過早干擾細胞貼壁?。
?三、傳代與凍存?
?傳代時機?

細胞融合度達80%時需傳代，超過90%易導致接觸抑制和老化?。
消化時間控制在1-3分鐘（0.25%胰酶），顯微鏡下觀察細胞變圓后立即終止?。
?凍存保護?

凍存液需含10% DMSO+90%胎牛血清，程序降溫（-1℃/min）至-80℃后轉液氮?。
?四、污染與質量控制?
?無菌操作?

超凈臺紫外照射30分鐘后操作，所有器械需酒精燈灼燒滅菌?。
定期檢測支原體（建議每2代檢測一次）?。
?細胞鑒定?

通過α-SMA免疫熒光染色或膠原合成功能實驗驗證細胞純度?。
?五、常見問題處理?
?貼壁不良?：檢查包被條件或血清批次，必要時更換培養基?。

?污染?：立即丟棄污染樣本，徹底消毒培養箱及操作臺?。

?六、注意事項?
原代細胞傳代不超過5代，3代內狀態最佳?。
避免反復凍融，凍存后細胞活性需通過臺盼藍染色驗證（存活率＞90%）?。
培養操作注意事項
七、無菌操作要求
使用大鼠角膜成纖維細胞完全培養基時，需全程保持無菌環境，操作前對超凈臺、培養瓶及工具進行消毒，避免污染影響細胞狀態。
培養基與環境控制
培養基不宜長時間暴露于室溫或高溫環境，凍融后若出現少量絮狀物，不影響使用，但需確保在保質期內使用，過期產品必須廢棄。細胞培養需維持37°C、5%CO?的恒溫恒濕環境，新鮮細胞收到后應立即放入培養箱靜置2-3小時穩定狀態。
細胞復蘇與傳代流程
凍存細胞復蘇時，需37°C水浴快速解凍，解凍后加入5ml培養基重懸，1000rpm離心5分鐘，棄上清后轉入新培養瓶培養；傳代時待細胞融合至80%，用PBS清洗后，以0.05%胰酶-EDTA消化，鏡下觀察細胞變圓后加入終止液終止，離心后分瓶。