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大鼠原代食管上皮細胞實驗操作步驟
發表時間：2025-07-08
大鼠原代食管上皮細胞實驗操作步驟
在完成大鼠原代食管上皮細胞的分離與培養后，接下來的實驗步驟需進一步優化細胞狀態，并開展相關功能研究。以下是后續關鍵操作流程：
1. 細胞換液與觀察
接種24小時后，在超凈工作臺中輕柔吸棄舊培養基，避免擾動貼壁細胞。加入預熱的完全培養基（含10%胎牛血清及1%雙抗），置于37℃、5% CO?培養箱繼續培養。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，健康的原代細胞應呈鋪路石樣緊密排列，若出現懸浮顆粒或大量脫落，需排查污染或消化過度問題。
2. 首次傳代處理
當細胞融合度達80%-90%時進行傳代。棄去培養基，用PBS輕柔沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分鐘。鏡下見細胞間隙增大后立即加入含血清培養基終止消化，吹打成單細胞懸液，按1:2比例接種至新培養瓶。原代細胞對酶敏感，需嚴格控制消化時間。
3. 功能實驗準備
傳代后的細胞需穩定24小時再進行后續實驗。若進行劃痕實驗或Transwell遷移 assay，需提前將細胞接種于6孔板或小室中，待融合至60%-70%時操作。對于屏障功能研究，可選用Transwell體系培養至形成緊密連接，通過測量跨膜電阻（TEER）評估完整性。
4. 凍存與質量控制
選取狀態良好的P2代細胞進行凍存。細胞懸液與凍存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分裝至凍存管，程序降溫后轉入液氮。復蘇后需檢測細胞活性（臺盼藍染色＞85%）及角蛋白19免疫熒光鑒定上皮源性。
?注意事項
- 原代細胞壽命有限，建議在P3代內完成關鍵實驗；
- 所有操作避免反復開蓋，以防pH波動影響細胞狀態；
- 功能實驗需設3次以上生物學重復以確保數據可靠性。
在完成大鼠原代食管上皮細胞的分離與培養后，接下來的實驗步驟需進一步優化細胞狀態，并開展相關功能研究。以下是后續關鍵操作流程：
1. 細胞換液與觀察
接種24小時后，在超凈工作臺中輕柔吸棄舊培養基，避免擾動貼壁細胞。加入預熱的完全培養基（含10%胎牛血清及1%雙抗），置于37℃、5% CO?培養箱繼續培養。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，健康的原代細胞應呈鋪路石樣緊密排列，若出現懸浮顆粒或大量脫落，需排查污染或消化過度問題。
2. 首次傳代處理
當細胞融合度達80%-90%時進行傳代。棄去培養基，用PBS輕柔沖洗2次，加入0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）消化30秒至1分鐘。鏡下見細胞間隙增大后立即加入含血清培養基終止消化，吹打成單細胞懸液，按1:2比例接種至新培養瓶。原代細胞對酶敏感，需嚴格控制消化時間。
3. 功能實驗準備
傳代后的細胞需穩定24小時再進行后續實驗。若進行劃痕實驗或Transwell遷移 assay，需提前將細胞接種于6孔板或小室中，待融合至60%-70%時操作。對于屏障功能研究，可選用Transwell體系培養至形成緊密連接，通過測量跨膜電阻（TEER）評估完整性。
4. 凍存與質量控制
選取狀態良好的P2代細胞進行凍存。細胞懸液與凍存液（90%血清+10% DMSO）按1:1混合，分裝至凍存管，程序降溫后轉入液氮。復蘇后需檢測細胞活性（臺盼藍染色＞85%）及角蛋白19免疫熒光鑒定上皮源性。
?注意事項
- 原代細胞壽命有限，建議在P3代內完成關鍵實驗；
- 所有操作避免反復開蓋，以防pH波動影響細胞狀態；
- 功能實驗需設3次以上生物學重復以確保數據可靠性。
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